Сучасні методи картування геномів. Картування та визначення первинної структури геному людини Методи картування генів типи генних карт
Найважливішим завданням молекулярної генетики стосовно медицини є ідентифікація генів спадкових захворювань людини і виявлення конкретних ушкоджень у яких, що призводять до розвитку фенотипічних проявів хвороби. Це завдання може пити виконана за допомогою декількох основних під-
\ОДОВ.
Перший підхід до ідентифікації генів, що залишався провідним приблизно до початку 90-х років,
| чзується на наявній інформації про основний біологічний дефект (первинний білковий продукт гена), що характеризує хворобу, що вивчається | Шишкін С.С., Калінін В.М.,] 992; Gardner Е. et al., 1991; Collins F., 1995].
I l"-вихід від білкового аналізу на рівень ДНК здійснювався через секвенування очищеного білкового продукту та отримання ДНК-зондів, використання моноклональних антитіл і за допомогою деяких інших методичних прийомів. Хромосомна локалізація гена в даній схемі пошуку є кінцевим результатом дослідження. Описаний підхід, який використовує ту чи іншу попередню інформацію про функціональне значення шуканого гена, отримав назву «функціональне клонування». Прикладом успішного застосування функціонального клонування є ідентифікація гена фенілкетонурії. первинні продукти гена чи патогномонічні біохімічні маркери невідомі.
Удосконалення молекулярних технологій призвело до створення принципово іншої стратегії пошуку гена, що не потребує будь-яких попередніх знань про його функцію або первинний біохімічний продукт. Ця стратегія передбачає ідентифікацію гена виходячи з точного знання його локалізації у певному хромосомному локусі - «позиційне клонування» (менш вдалий термін «зворотна генетика») . Позиційне клонування веде до встановлення молекулярної основи хвороби від гена до білка і включає наступні основні етапи: 1) картування гена хвороби в певній ділянці конкретної хромосоми (генетичне картування); 2) складання фізичної карти хромосомної області, що вивчається (фізичне картування); 3) ідентифікація послідовностей ДНК, що експресуються, в області, що вивчається; 4) секвенування генів-кандидатів та виявлення мутацій у шуканому гені у хворих осіб; 5) аналіз структури гена.
розшифровка послідовності та первинної структури його продуктів-мРНК та білка. У ряді випадків позиційне клонування гена полегшується при виявленні у хворих на видимі цигогенетичні перебудови або визначені делеції в критичній хромосомній ділянці, що дозволяють значно підвищити точність картування мутантного гена. Виявлення таких перебудов сприяло зокрема успіху в клонуванні генів міодистрофії Дюшепна/Бекера, нейрофіброматозу 1-го типу, туберозного склерозу, адренолейкодистрофії та інших спадкових захворювань нервової системи.
Одним з важливих проміжних результатів дослідницького просто «Геном людини» стала створення все більш і більш насиченої транскрипційної карти геному, що містить відомості про тисячі вже відомих генів і нуклеотидних послідовностей, що експресуються. Це сприяло значному розвитку ще одного підходу до ідентифікації первинного генетичного дефекту, при якому після попереднього картування мутантного гена проводиться скринінг відповідних генів-кандидатів, розташованих у тій самій хромосомній ділянці (lt; lt; positional candidate approach). Даний метод передбачає наявність певних знань про патофізіологію захворювання, що вивчається, що дає можливість проводити раціональний відбір гепів-кандидатів для аналізу з великої кількості генів, які можуть бути розташовані в «зоні інтересу». Серед неврологічних спадкових захворювань, гени яких були ідентифіковані таким чином завдяки аналізу відповідних кандидатів у встановленому хромосомному інтервалі, можна назвати дофа-залежну дистонію та фрідрейхоподібну атаксію з дефіцитом вітаміну Е. За існуючими прогнозами, саме аналіз «позиційних кандидатів» стане в найближчому майбутньому провідним методом ідентифікації генів спадкових хвороб, чому значною мірою сприяє створення і постійне розширення комп'ютерних баз даних послідовностей, що експресуються, на хромосомах («expressed sequence tags») .
Таким чином, визначення хромосомної локалізації шуканого гена – генетичне картування – є першим, ключовим кроком на шляху до розкриття молекулярної основи того чи іншого спадкового захворювання.
Існує кілька основних методів, що дозволяють картувати невідомий ген у конкретному хромосомному локусі: а) клініко-генеалогічний (найпростіший і найдавніший) - заснований на аналізі успадкування ознак у великих родоводах; прикладом може бути встановлення локалізації гена на Х-хромосомі у разі передачі хвороби за Х-зчепленим типом; б) цитогенетичний - базується на асоціації хромосомних перебудов, що виявляються при мікроскопії, з певним клінічним фенотипом; в) метод гібридизації in situ (у тому числі його сучасна модифікація – флюоресцентна гібридизація in situ, FISH) – використовує специфічну гібридизацію мРНК та кДНК шуканого гена з денатурованими хромосомами на метафазних препаратах клітини; г) метод гібридних клітин - заснований на аналізі спільної сегрегації клітинних ознак і хромосом у клонованих in vitro гібридних соматичних клітинах [Фогель Ф., Мотульський А., 1990; Gardner Е. та ін., 1991]. Всі ці методи знайшли своє застосування в сучасній молекулярній генетиці, однак вони мають серйозні обмеження, пов'язані як з недостатньою роздільною здатністю, так і з існуванням жорстких передумов, необхідних для проведення дослідження (таких як наявність зондів, доступність селективних систем для відбору гібридних клітин і т.п.). Найбільш потужним, продуктивним і широко використовується в даний час методом картування генів спадкових хвороб людини є так званий linkage-аналіз - аналіз зчеплення гена, що шукається, з набором точно локалізованих генетичних маркерів.
Центральне положення linkage-аналізу полягає в тому, що мірою відносної генетичної відстані між двома локусами на хромосомі може служити частота рекомбінацій між цими локусами в результаті гомологічних кросинговеру хромосом в мейозі. Чим ближче розташовані локуси па хромосомі, I їм більша ймовірність того, що вони будуть успадковуватися як єдине ціле (група зчеплення); при значній віддаленості досліджуваних локусів (тобто слабкого ступеня зчеплення) вони з більшою ймовірністю розійдуться після кросинговеру з різних хромосом. Частота рекомбінації між локусами 1% прийнято за одиницю
- єнетичної відстані між ними - 1 сантиморганіду (СМ), що еквівалентно в середньому 1 мільйон п.о. Слід наголосити, що частота рекомбінацій і, отже, генетична відстань, неоднакові для чоловіків і жінок (більше у жінок), для різних хромосом, а також для різних ділянок однієї хромосоми («гарячі точки» рекомбінації).
Мал. 30. Принцип аналізу генетичного зчеплення на прикладі аутосомно-домінантного захворювання У цьому прикладі досліджено 4 зчеплені маркери А, В, С та D, за якими реконструйовані гаплотипи. Різні за походженням хромосоми марковані різними типами штрихування (початкова мутантна хромосома позначена чорним кольором). Всі хворі в родоводі мають ту саму загальну (середню) частину вихідної мутантної хромосоми. Наприклад, у нижньому поколінні хромосоми зазнали ряд рекомбінацій, проте у всіх хворих на сибси (у тому числі в осіб Ш-З і Ш-8) зберігається один і той же мутантний гаплотип за маркерами В і С (гаплотип у). Навпаки, ніхто зі здорових сібсів у нижньому поколінні не успадкував від батька гаплотип j за маркерами В і С (індивід Ш-4 успадкував хромосому, в якій рекомбінація відбулася нижче критичного сегмента). Таким чином, сегрегація маркерних алелів та аналіз гаплотипів свідчать про те, що ген захворювання розташований у хромосомному сегменті, що включає маркери В і С. Відповідно, зовнішніми межами ділянки хромосоми, в межах якого розташований мутантний ген, є маркери А і D.
і той самий аллель досліджуваного маркера, це свідчить про відсутність рекомбінацій між шуканим мутантним геном і маркером, тобто. про наявність зчеплення між ними. Приклад зчеплення між геном аутосомно-домінантного захворювання та певними генетичними маркерами представлений на рис. 30.
Для достовірного доказу зчеплення розроблено спеціальний математичний апарат. Принцип розрахунку полягає у зіставленні ймовірностей гіпотез про наявність та відсутність зчеплення при наявних сімейних даних та обраній частоті рекомбінацій 0; співвідношення цих двох ймовірностей (співвідношення правдоподібностей) виражає шанси за та проти зчеплення. Для зручності використовується десятковий логарифм співвідношення правдоподібностей - Лод-бал (від англ. Logarithm of the Odds, або LOD):
Po
LOD = Logio -
P1/2 де P - ймовірність
отриманого розподілу сімейних даних для зчеплених генів із частотою рекомбінацій 0, Р - ймовірність такого розподілу для двох незчеплених вільно рекомбінуючих генів (частота рекомбінацій 0 = 1/2). Використання логарифмічної форми розрахунку дозволяє проводити додавання 27од-балів, отриманих під час аналізу окремих родоводів. Для доказу генетичного зчеплення прийнято значення Лод-балла +3, що означає співвідношення шансів 1000:1 на користь наявності генетичного зчеплення междgt; маркером і ознакою, що вивчається. Лод-Бал -2 і нижче свідчить про достовірну відсутність зчеплення; Значення Лод-балу від +3 до - 2 є, відповідно, більш менш ймовірними з точки зору наявності зчеплення і потребують подальшого підтвердження. Частота рекомбінацій 0, для якої було виявлено максимальний Л од-бал, є відображенням найбільш ймовірної генетичної відстані між локусами, що вивчаються; Орієнтовно вважається, що 1% рекомбінацій свідчить про дуже тісне зчеплення, частота рекомбінацій близько 5% - про хороше зчеплення і частота 10-20% - про деяке помірне зчеплення.
Розрахунок Лоб-балів передбачає використання спеціального комп'ютерного програмного забезпечення (програма LIPED, пакет програм LINKAGE та ін.).
Для успіху linkage-аналізу необхідно, щоб досліджувані сім'ї були інформативні через хворобу та генетичний маркер. Перше означає наявність достатньої кількості інформативних мейозів у родоводі, що дозволяють аналізувати розбіжність ознак у даному родоводі. З практичної точки зору це означає наявність великої кількості доступних для аналізу хворих та здорових родичів, як правило, з кількох поколінь. Інформативність за маркером передбачає його поліморфізм (тобто існування великої кількості алелів) та гетерозиготність у ключових членів сім'ї, що дозволяє диференціювати генетичне походження конкретних алелей маркера. До кінця 80-х років основним типом маркерів, що використовуються в аналізі зчеплення, були ділянки ДНК хромосом, що мають у своєму складі варіацію в одній парі основ і розрізняються за наявністю або відсутністю ділянки рестрикції відповідного ферменту, тобто. по довжині рестрикційних фрагментів ("restriction fragment length polymorphism", RFLP). Нова ера в генетичному картуванні настала з відкриттям класу високополіморфних маркерів, що становлять ділянки ДНК, що складаються з варіабельного числа копій тандемних (СА)п-повторів і мають надзвичайно високу гетерозиготність. Це дозволило значною мірою вирішити проблему інформативності маркерів і сприяло суттєвому прогресу linkage-аналізу. За деякими оцінками, для скринінгу повного гаплоїдного геному та виявлення генетичного зчеплення необхідно мати 200-300 високополіморфних маркерів, рівномірно розподілених за хромосомами. Генетичні карти останнього покоління включають понад 5000 таких маркерів, що дозволяє вважати сьогодні завдання встановлення генетичного зчеплення принципово можливим у будь-яких інформативних родоводів.
Серйозною проблемою, з якою доводиться стикатися при проведенні аналізу зчеплення на серії сімей, є проблема можливої генетичної гетерогенності клінічного синдрому, що вивчається. У випадку, якщо фенотип, що вивчається, може викликатися мутаціями в різних генах, механічне додавання отриманих в окремих сім'ях позитивних (за наявності зчеплення) і негативних (за його відсутності) Лод-балів веде до нівелювання сумарного значення Лод-балу і помилкового висновку про повну відсутність зчеплення . Прикладом може бути аутосомно-домінантна моторно-сенсорна невропатія 1 типу, обумовлена мутаціями в різних генах, локалізованих на 1-й, 17-й та інших хромосомах. У цій ситуації особливого значення набуває ретельне, детальне обстеження хворих та сімей, що направляються для linkage-аналізу, з метою відбору максимально однорідних клінічних груп. Додатковим способом уникнути хибно-негативного результату дослідження є використання в процесі розрахунку
та/7од-балів спеціальної програми HOMOG або аналогічних їй програм, що дозволяють оцінювати ймовірність генетичної гетерогенності при отриманому конкретному наборі сімейних даних. Найбільш дієвим підходом на першому етапі дослідження є аналіз зчеплення в одному великому інформативному родоводі, що дозволяє свідомо позов почати можливість генетичної гетерогенності в групі хворих, що вивчається. Додаткові складності при проведенні linkage-аналізу пов'язані з неповною пенетрантністю, що нерідко спостерігається, і варіабельною експресивністю мутантного гена, наявністю фенокопій серед обстежуваних членів сім'ї, оцінкою віку початку хвороби і можливості доклінічного носійства мутації, оцінкою поширеності конкретних оцінок. . . Неправильний облік або недооцінка цих факторів можуть суттєво вплинути на підсумковий результат, тому якість докладного клініко-генеалогічного аналізу в сім'ях, що вивчаються, виступає на перший план.
Розроблено багато нових методів, що являють собою подальший розвиток традиційної стратегії дослідження генетичного зчеплення і істотно підвищують швидкість виконання, методичні можливості та здатність даного аналізу в локалізації невідомих генів спадкових захворювань людини. Одним з таких методів є мультилокусний аналіз (multipoint linkage analysis), що дозволяє оцінювати Лод-бали для сукупності зчеплених локусів відповідно до генетичної карти хромосомної ділянки, що вивчається, і визначати найбільш ймовірну локалізацію мутантного гена в межах даної ділянки . В інбредних
родоводів з аутосомно-рецесивним захворюванням за наявності припущення про «ефект засновника» виключно продуктивним зарекомендував себе метод гомозиготного картування: він полягає в аналізі «гомозиготності за походженням» («homozygosUy-by-descent») і дозволяє оцінити ступінь гомозигот серії маркерів як результат успадкування від єдиного предка загальної хромосомної ділянки, що включає мутантний ген. Багатообіцяючим є метод «економного сканування геному», що передбачає переважне використання маркерів, локалізованих у «стратегічних» CG насичених хромосомних областях, багатих на послідовності, що експресуються. Запропоновано також низку інших модифікацій класичного linkage-аналізу.
Важливо наголосити, що аналіз зчеплення збереже своє значення і після ідентифікації всього геному людини. Наприклад, при вивченні досі досить великої групи спадкових захворювань з невстановленими генами першим кроком на шляху до з'ясування молекулярного дефекту може служити /ш/ш^е-апаліз і визначення хромосомного локусу хвороби, з наступним скринінгом відповідних генів у цій галузі. Надзвичайно важливою в успіху генетичного картування є роль клініциста. Вона полягає в адекватному відборі репрезентативних сімей, детальній оцінці клінічного статусу всіх включених у дослідження членів сім'ї, точній діагностиці хвороби та оцінці характеру сегрегації мутантного гена, а також вирішенні багатьох інших ключових питань.
Картування генів gene mapping, mapping- картування генів.
визначення положення даного гена на будь-якій хромосомі щодо інших генів; використовують три основні групи методів К.р.- фізичне (визначення за допомогою рестрикційних карт, електронної мікроскопії та деяких варіантів електрофорезу міжгенних відстаней - у нуклеотидах), генетичне (визначення частот рекомбінацій між генами, зокрема, у сімейному аналізі та ін.) та цитогенетичне (гібридизації in situ<in situ hybridization>, одержання монохромосомних клітинних гібридів<monochromosomal cell hybrid>, делеційний метод<deletion mapping> та ін); в генетиці людини прийняті 4 ступені надійності локалізації даного гена - підтверджена (встановлена у двох і більше незалежних лабораторіях або на матеріалі двох і більше незалежних тест-об'єктів), попередня (1 лабораторія або 1 аналізована сім'я), суперечлива (несупад даних різних дослідників), сумнівна (не уточнені дані однієї лабораторії); у Додатку 5 наведено зведення (станом на 1992-93) структурних генів, онкогенів та псевдогенів у геномах людини та - включаючи деякі мутації - миші.
(Джерело: «Англо-російський тлумачний словник генетичних термінів». Ареф'єв В.А., Лісовенко Л.А., Москва: Вид-во ВНІРО, 1995 р.)
Дивитись що таке "картування генів" в інших словниках:
картування генів- визначення положення даного гена на якійсь хромосомі щодо інших генів; використовують три основні групи методів К.р. фізичне (визначення за допомогою рестрикційних карт, електронної мікроскопії та деяких варіантів електрофорезу.
Картування генів- Визначення положення даного гена на будь-якій хромосомі щодо інших генів. Генетичне картування передбачає визначення відстаней частоти рекомбінацій між генами. Фізичне картування використовує деякі методи. Словник із психогенетики
картування [генів] за допомогою беккросування- генетичний метод картування, заснований на отриманні беккросних гібридів споріднених форм та аналізі розщеплення варіантів алелів, поліморфних за довжинами рестрикційних фрагментів; найбільш поширений даний метод у картуванні генів у ... Довідник технічного перекладача
Backcross mapping картування [генів] за допомогою беккроссування. Генетичний метод картування, заснований на отриманні беккросних гібридів споріднених форм та аналізі розщеплення варіантів алелей, поліморфних за довжинами рестрикційних…
Картування порівняльне генів ссавців- * картування параўнальне генів ссавців * comparative mapping of mammalian genes інформативне зіставлення генетичних карт людини та будь-якого з інших видів ссавців). Вони повинні бути одночасно добре вивчені і далеко відстояти один.
Картування- * картування * mapping встановлення позицій генів чи якихось певних сайтів (див.) вздовж нитки ДНК (. Карта) … Генетика. Енциклопедичний словник
Картування за допомогою опромінених гібридів [клітин]- * картування за допомогою апраменених гібридів [клітин] * radiated hybrid mapping модифікація методу картування генів з використанням гібридизації соматичних клітин. Клітини гібридного клону «гризун Ч людина», що містять тільки хромосому 1… Генетика. Енциклопедичний словник
Radiation hybrid mapping картування за допомогою опромінених гібридів [клітин]. Модифікація методу картування генів з використанням гібридизації соматичних клітин клітини гібридного клону “гризун ˟ людина”, що містять лише 1 хромосому. Молекулярна біологія та генетика. Тлумачний словник.
Встановлення порядку розташування генів та відносної відстані між ними у групі зчеплення. Великий медичний словник
1.1. При цитологічному картуванніВивчення диференціально забарвлених хромосом дозволяє виявити великі хромосомні перебудови шляхом порівняння досліджуваного зразка з контрольним.
1.1.1. Гібридизація in situ: ISH-і FISH-гібридизація
Прямим методом картування генів на хромосомі є метод гібридизації нуклеїнових кислот. Варіації методу (гібридизація in situ - на місці) та FISH використовуються у тих випадках, коли є проби, або зонди з відомими (секвенованими) нуклеотидними послідовностями. Зонди – це штучно синтезовані мічені: радіоактивними ізотопами або флуоресцентними барвниками – хімічно невеликі (10-30 нуклеогідів) сегменти одноланцюгової ДНК (або РНК), комплементарні шуканому гену. Ці короткі олігонуклеотиди поєднуються тільки з тією ділянкою ДНК, яка містить послідовність нуклеотидів, суворо відповідну (комплементарну) послідовності нуклеотидів зонда. Отже, наявність мітки, що зв'язалася з ДНК, з високою точністю свідчить про присутність в аналізованому зразку шуканих послідовностей нуклеотидів.
Локуси генів, комплементарні зондам, можуть бути картовані безпосередньо на хромосомі шляхом реєстрації радіоактивної мітки.
1.1.2. Хромосомний пейнтінг
Одним із найбільш вирішальних методів є багатобарвна флуоресцентна гібридизація або хромосомний пейнтінг (хромосомний живопис). Для отримання кольорових зображень використовують різні флуорохроми, якими мітять різні зонди ДНК. Інформація про інтенсивність світіння кожного флуорохрому записується на комп'ютері окремо і кожному з таких зображень надається свій власний псевдоцвіт.
1.1.3. Гібридизація соматичних клітин
При цитологічному картуванні використовується також гібридизація соматичних тіток. В умовах культури можна отримати соматичні гібриди клітин людини та різних гризунів: людина – миша, людина – щур, людина – хом'як. Так, до 2002 був повністю вивчений геном миші. Виявилося, що багато генів у геномі миші гомологічні за структурою генів людини.
1.2. Генетичне картування
Генетичні карти - це карти-схеми взаємного розташування генів на індивідуальних хромосомах, тобто. що знаходяться в одній групі зчеплення.
Принципи генетичного картування були розроблені Т. Морганом. Їм була складена перша генетична карта X-хромосоми дрозофіли, заснована на обліку частоти утворення кросоверних і некросоверних гамет у самок, гетерозиготних по рецесивним мутаціям, локалізованим в Х-хромосомі. Так. в мейозі гетерозиготних самок кросинговер між генами у (жовте тіло) і w- (білі очі) відбувався в 1,5% випадків, між генами w і m (мініатюрні крила) -34,5%, а між генами у і т - 36 % випадків.
Генетичні карти зчеплення правильно відбивають порядок розташування генів (чи генетичних маркерів) на хромосомах, проте відстані з-поміж них мають відносні значення, тобто. не відповідають реальним фізичним відстаням.
1.3 . Молекулярні маркери ДНК та їх використання для генетичного картування
1.3.1. ПДРФ - маркери ПДРФ (поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів ДНК,
Було встановлено, що генетичним маркером може бути будь-яке місце в геномі, де відбулася зміна в послідовності ДНК, яка виявляється як внутрішнє різницю між індивідами в популяції, але ніяких зовнішніх (фенотипних; відмінностей між ними при цьому не спостерігається).
У бактерій встановлено і виділено цілу низку ферментів рестриктаз, які дізнаються специфічні послідовності в молекулі ДНК (зазвичай складові 4-6 нуклеотидів) і розрізають подвійну спіраль усередині або поблизу сайту впізнавання, в результаті чого утворюються рестрикційні фрагменти, або рестрикти.
Відсутність сайту розпізнавання може бути пов'язана з делецією. інсер-цією чи заміною нуклеотидів. Отже, будь-яка мутація, що змінює послідовність нуклеотидів сайту рестрикції, знищує цей сайт.
1.3.2. Молекулярні маркери, засновані на полімеру гній ланцюгової реакції (ПЛР-маркери)
Принципи методу ПЛР. Полімеразна ланцюгова реакція імітує природний процес відтворення (подвоєння) ДНК - реплікацію, що відбувається на матричній основі (за принципом комплементарності) за участю ферменту ДНК-полімерази. Але якщо під час реплікації подвоюється вся ДНК, то при ПЛР - відбувається багаторазове копіювання (відтворення, ампліфікація) лише дослідника, що цікавить специфічного, невеликого фрагмента, розташованого між двома праймерами.
1.3.3. Мікросателіти та мінісателіти як молекулярні маркери
Різновидами сатДНК є. мікросателіти (МКС, або прості послідовності, що повторюються - ППП) і мінісателіти (МНС). Мінімальна одиниця (КОР) мікросателітів, що повторюється, включає від 1 до 10 пар нуклеотидів, мінісателітів - 15 -70 пн. Їхнє розташування в геномі і число повторень корових одиниць специфічні для кожного організму.
1.4. Фізичне картування
Фізичне картування ґрунтується на прямому аналізі молекул ДНК. складових кожну хромосому (без аналізу результатів схрещування) Його кінцева мета - визначення послідовності нуклеотидів у кожній хромосомі.
1.4.1. Створення рестрикційних карт
Рестрикційне картування засноване на встановленні точок дії різних рестриктаз. Розподіл сайтів рестрикції є своєрідним паспортом кожного фрагмента ДНК і може використовуватися для його ідентифікації.
Банк генів.І тому фрагменти ДНК організму приєднують до векторних молекул, тобто. молекулам-переносникам чужорідних генів Як вектори використовують плазміди бактерій, фаги (віруси, що інфікують бактерії), косміди (гібридні молекули, отримані з ДНК фага К і бактеріальної плазміди; завдяки наявності cos-ділянки фага А., який забезпечує замикання його лінійної ДНК в кільце, космідна ДНК, що включила чужорідні гени, може бути упакована в головку бактеріофага). Як вектори використовують також штучні хромосоми дріжджів YAK - (ЯК) і бактерій ВАС - (БАК) хромосоми.
1.4.2. Створення упорядкованих бібліотек клонів. Мапи контиг.
Процедура "Прогулянка хромосомою"
Щоб встановити порядок розташування клонів (тобто клонованих фрагментів ДНК) на хромосомі (за її довжиною), необхідно виявити ділянки їхнього часткового перекривання. Це можна зробити шляхом гібридизації нуклеїнових кислот, якщо відома нуклеотидна послідовність хоча б одного фрагмента. Його мітять радіоактивно або флуорохромом і використовують як зонд для створення впорядкованих бібліотек клонів.
"Прогулянка хромосомою"(Ковзне зондування). Для впорядкування клонів використовують дві різні бібліотеки геномної ДНК, отримані з ДНК одного й того ж організму, але розділені двома різними рестриктазами. Якщо один з генів (або клонів) в першій бібліотеці вдалося картувати і клонувати (тобто отримати з нього ДНК-маркуючий сайт - STS), він потім може бути використаний як зонд для виявлення клону, що перекривається в другій бібліотеці. А вивчений клон другої бібліотеки може використовуватися як зонд для іншого фрагмента першої бібліотеки, що перекривається, і т.д.
Таким чином, встановлюється порядок розташування клонів на хромосомі.
1.4. Визначення нуклеотидної послідовності геному (секвенування) Вичерпна фізична карта геному людини (і будь-якого іншого організму) повинна являти собою повну послідовність нуклеотидів ДНК усіх її хромосом.
1.5. Кандидатне картування
У цих підходів картувати ген означало пройти шлях від його функції до локалізації на хромосомі (позиції).
Картування – найпростіший спосіб зстикувати контиги.
Картування геномів може бути генетичне та фізичне.
Генетичне картування:
Містить ген – фенотипний маркер;
Молекулярні маркери:
RFLP (поліморфізм довжин рестрикіційних фрагментів) - це спосіб дослідження геномної ДНК, шляхом розрізання ДНК за допомогою ендонуклеаз рестрикцій (розщеплюють нуклеїнові кислоти в середині) і подальший аналіз фрагментів (рестриктів), що утворилися, шляхом гель-електрофорезу;
SSLP (поліморфізм довжин простих повторів) - Їх є 2 типи: мінісателіти та мікросателіти. Мікросателіти- Повтор 2,3,4 н.п. Це помилки у роботі ДНК-полімерази. Коли є ділянка, де багато разів повторюється олігонуклеотид, є можливість прослизання ДНК-полімерази. Вона з певною часткою ймовірності може дисоціювати з матрицею та приєднатися до сусіднього повтору. В результаті при реплікації буде або на один повтор більше або на один менше;
SNP ( Поліморфізм за одиночними нуклеотидами) –відмінності послідовності ДНК розмірів один нуклеотид в геномі представника одного виду;
Детекція молекулярних маркерів:
1. Гібридизація ДНК:
1.1. Зонди спарюватимуться з одноланцюжковою ДНК, утворюються повні або неповні комплементи.
1.2. Електрофорез у ПАА. Перенесення за допомогою нітроцелюлозного паперу. Радіомічені проби гібридизуються з ДНК. Виявляються авторадіографічно.
Використовується для детекції молекулярних маркерів:
1. Повторюваних локусів;
2. Поліморфізм рестрикційних фрагментів (ПДРФ, RFLP) - обробка рестриктазою.
Типи повторів:
1. Короткі (2-4 н.) Поліморфізм довжин простих послідовностей (SSLP);
2. Мінісателіти (до 25 н.) VNTR;
3. Мікросателіти (ді-або тетрануклеотиди) STR, SSR;
Поліморфізм за одиночними нуклеотидами в агарозному гелі (SNP);
(AGTCA G AAATC);
(AGTCA C AAATC);
Використання ДНК-чіпів методом фотолітоавтографії.
Скляна підкладка обробляється, на неї наноситься нуклеотид. 5'-кінець блокується, освітлення лазером видаляє блокуючу угруповання. Так можна завдати сотні тисяч зондів.
Негібридизуючі фрагменти відмиваються; визначається по плямах (від флуоресцентно міченої ДНК).
Недоліки:
1. Обмежена роздільна здатність (максимум 1 ген на 3.3 кн. у E. coli і 1 ген на 10 кн. у S. cerevisiae);
2. Обмежена роздільна здатність через нерівномірність кросинговера.
Основні методи фізичного картування:
1. Рестрикційне картування;
2. FiSH (флуоресцентна гібридизація in situ);
3. Картування STS;
Рестрикційне картування – це визначення відносного розташування та певних сайтів рестрикції на геномній карті та визначення відстаней між ними.
Особливості великих ділянок:
1. Використання рестриктаз, що розпізнають 7-8 н.;
2. Використання рестриктаз, до сайту розпізнавання яких входять рідкісні комбінації нуклеотидів;
3. Використання спеціальних методик гель-електрофорезу зі змінним електричним полем для поділу великих фрагментів ДНК.
Класичним походом є електрофорез визначення розмірів фрагментів. Потрібно як мінімум 2 рестриктази, кожна з них обробляє фрагмент ДНК, що досліджується.
Перше, що потрібно зробити, це підібрати рекстриктазу, яка розрізає рідше, щоб вийшло розумне число фрагментів. Тут ось статистично розрахована частота народження сайтів для різних ендонуклеаз з різним розміром сайту. Беруться рестриктази, які мають найдовший сайт, плюс підбираються спеціально ще такі рестриктази, в сайтах яких є рідкісні комбінації нуклеотидів. Таким чином, ми отримуємо реакцію рестрикції з розумною кількістю фрагментів, але потрібно все одно визначити розмір цих фрагментів. Для того щоб визначити розмір великих фрагментів використовуються спеціальні методики: або електрофорез у змінному полі, або інші способи візуалізації, які об'єднуються під назвою оптичне картування .
Перше – таким чином можна знайти можна знайти ферменти, які ще рідше різатимуть. Зокрема на прикладі геному людини, цей сайт показує, чому у нас мало CG комбінацій. У геномі людини CG літери розташовані поруч, зустрічаються тільки в промоторних областях. Відповідно здебільшого геному вони відсутні. Чому так відбувається? Бо цитозин метилюється, тобто. відбувається приєднання метильної групи. Був цитозин, вийшов 5-метилцітозін. Будь-яка аміногрупа у складі азотистих основ із досить високою ймовірністю здатна гідролізуватися. Залишок від гідролізу – заміна аміногрупи на оксогрупу, а якщо відбувається заміна цитозину, то ми отримуємо урацил, який є парною основою і відповідно системою репарації вирізається, але якщо це 5-метилцитозин, то ми отримуємо тімін, а це легальна основа у складі ДНК. Відповідно якщо літера С не критична у відповідному місці геномної послідовності, то еволюційний тиск досить жорсткий - заміна літери С на букву Т. Еволюційний тиск буде більшим у кодуючій послідовності і в промоторній послідовності, тому що метильовані CG послідовності є важливим регуляторним сигналом який контролює. Це так звані CPGS-права там де вони майже напевно буде регуляторна область, яка активована. Таким чином якщо завдання - підібрати рідкісні рестриктази, то потрібно підібрати такі рестриктази в сайт яких входять ці комбінації нуклеотиди. Давайте подивимося що виходить .
Один з варіантів це електрофорез у пульсуючому полі. Стандартний електрофорез дуже погано підходить для фрагментів із понад 50 тис. н.п. Вони всі збираються в купку нагорі гелю, не поділяються, деякі з них взагалі залишаються у лунці. Щоб їх розділити змінюються умови електрофорезу – два електроди змінюються на 4 і напруга подається змінне то однією електрод, то інший. Коли подається напруга перший електрод фрагмент ДНК рухається дуже коротке відстань, застряє в порах агарози. Напруга змінюється, струм подається інші електроди, фрагмент ДНК висмикується з тих осередків у яких він застряг і трохи рухається, потім напрям знову змінюється. Рух виходить зигзагоподібний. Але кроки дуже короткі і підсумовуються в лінійний рух. Практично виходить стандартний електрофорез, різниця у цьому великі фрагменти будуть чітко розділені, т.к. рухливість зовсім інша. Не так жорстко прив'язана до багатьох фрагментів. Електрофорез має один великий недолік – це не прямий вимір розмірів ДНК. По одній з доріжок бігтиме молекулярний маркер і йде зіставлення довжини пробігу - непрямий показник.
Те, що називається оптичним картуванням – заміна електрофорезу, тут розмір фрагментів вимірюється безпосередньо. Суть його полягає в тому, що ДНК одним із кількох способів розпрямляється, із скрученого клубка вона витягується. Причому витягується під напругою. Причому напруга молекули ДНК, що обробляються рестриктазою, після розрізання кінці молекули роз'їжджаються в сторони від місця розрізу, це все можна побачити під мікроскопом. Потім такий препарат мікроскопується, ДНК фарбується флуоресцентним барвником, що інтеркалює, і місця розриву видно. Прямий вимір довжини під мікроскопом. Два варіанти отримання лінійних напружених ДНК: в обох випадках використовується властивість кордону між різними фазами. Коли ДНК проходить через фазовий розділ, витягується. Перша з методик використовує ДНК у розчині розплавленої агарози. ДНК наноситься на предметне скло, через деякий час агароз починає застигати. Застигання ніколи не йде поступово, воно завжди починається в якомусь місці. Фронт кристалізації агарози рухається з початкової точки та поширюється. Коли він проходить через молекулу ДНК, він тягне цю молекулу за собою і в результаті ми отримуємо вирівняну молекулу в напруженому стані. Потім сюди додається фермент, у деяких випадках фермент відразу іммобілізований на склі, а потім додаються іони магнію разом з відповідним буфером, а може навпаки – потім фермент. Але краще перший варіант – краще дифундує. Інший метод заснований на тому, що покривне скельце дуже повільно дістається з розчину ДНК. Воно обробляється розчином силаном, який збільшує сорбцію ДНК, молекули якоюсь частиною сорбуються на цій скельці і воно дуже повільно, по парі міліметрів на годину витягується з розчину і коли воно проходить через плівку поверхневого натягу молекули ДНК витягуються від того місця, де вони зафіксовані вниз. Напрямок протилежний руху скельця. Ми отримуємо вирівняну молекулу в напруженому стані, потім скельця обробляється рестриктазою.
При неспареному стані гібридизації немає. Детекція SNP методом гібридизації у розчині. При гібридизації шпилька розкривається.
Наступна методика картування флуоресцентна гібридизація на препаратах – FISH .
Тут безпосередньо візуалізується якийсь локус, відповідно до позиції флуоресцентного зонда на пофарбованих цитологічним барвником препарату хромосом (скручені хромосоми). Препарат наноситься на скло, фіксується на ньому та піддається частковій денатурації. В результаті ми отримуємо по довжині хромосоми ділянки в одноланцюжковому стані. Потім додається проба, яка гібридизується з цими ділянками, і потім такий апарат забарвлюється відповідними барвниками і мікроскопується. Мікроскопія ведеться у видимому діапазоні, флуоресцентна мікроскопія. Проба опромінюється лазером у певній довжині хвилі та спостерігається флуоресценція. В результаті ми повчаємо картину флуоресценції накладену на характерну для цієї хромосоми картину смуг. Ми зробили зонд під конкретний ген і відразу бачимо, де на хромосомі цей ген розташований.
Недоліки: роздільна здатність досить невисока, трохи більше 1 млн.н. п. між сусідніми зонами. Щоб підвищити роздільну здатність використовуються модифікації методик.
Найпростіша практично нічого не змінює – механічне розтягнення хромосом. Препарат хромосом крутиться у центрифузі на невеликих обертах. Хромосоми витягуються під впливом відцентрових сил, головне не переборщити з оборотами. Білки не з'єднуються залишаються в тих позиціях, в яких вони зафіксовані і можна пофарбувати. Дозвіл у 4-5 збільшується. До 200 тис. н. між сусідніми маркерами. Якщо потрібно вищу роздільну здатність використовуються інші модифікації - не метафазні хромосоми (дозвіл до 20-25 тис.н.п.) і fiber-FISH, ті ж хромосоми, тільки які додатково розтягнуті - розтягування в гелі, молекулярне «зачісування», дозвіл до 10 тис. зв. п. Нестача цих двох методик – ми можемо прив'язати флуоресцентний зонд до цитологічної карті. Ми можемо тільки розташувати два зонди один щодо одного і визначити відстань між зондами. Повинен бути зонд, позиція якого відома, і ми повинні одночасно бачити і цей зонд, і той зонд, який нас цікавить.
Ще один спосіб картування це STS-картування . Воно чимось нагадує генетичне картування, але використовує не рекомбінацію, а інший спосіб визначення відносної відстані. Критерієм тут є частота фрагментації ДНК при побудові геномних бібліотек та фрагментів. Фактично суть та сама: розрив молекули ДНК відбувається під дією низького ультразвуку або під дією рестриктаз. відмінність також у тому, що є маркерами. STS-маркери – це відомі фрагменти ДНК, які зустрічаються в геномі один раз і послідовність має бути відома.
Коли така послідовність відома, можна підібрати пару праймерів в межах цих 100-500 н. п. і отримати ПЛР фрагмент, яким зазвичай такий маркер і детектується. Найпростіший спосіб відбору послідовностей для одержання цих маркерів – це використовувати EST сіквенси – це коротенькі шматочки кДНК, зроблені на матричній РНК. Оскільки це копія мРНК вона гарантовано зустрічається один раз в геномі, оскільки більшість генів є унікальними. Відповідно, це спочатку унікальна послідовність. Інші маркери, менш зручні, маркери поліморфні за простими послідовностями – міні-сателіти або мікросателіти. Можна використовувати і випадкові геномні послідовності, але із нею складніше т.к. Треба чітко доводити, що вони унікальні геномні послідовності. Щоб визначити позицію таких маркерів потрібен інший компонент – реагент картирования. Це просто набір фрагментів ДНК тієї чи іншої бібліотеки. Чим маркери ближче один до одного на реальній карті хромосоми, тим вища ймовірність, що вони опиняться в тому самому фрагменті ДНК.
Тісно зчеплені маркери, поруч розташовані відповідно, вони потрапляють у велику кількість фрагментів. Маркери розташовані далі, найчастіше потрапляють на різні фрагменти ДНК, Якщо маркери виявляться ще далі – відстань між ними перевищуватиме розмір фрагментів бібліотеки, вони взагалі не детектуватимуться спільно. Все це статистично общипується – можна за частотою спільного знаходження цих маркерів у бібліотеці досить точно визначити відстань між ними на реальній карті хромосом. За умови, що фрагментація лише випадкова. Джерела фрагментів: стандартна клонотека, набір клітин-радіаційних гібридів.
Клітини-радіаційні гібриди найбільш зручні при STS-картуванні. Це стара технологія, власне варіант клонування еукаріотичної ДНК in vivo. Йдеться про гібридизацію опромінених клітин з неопроміненими клітинами. Причому неопромінені клітини, зазвичай, клітини китайського хом'ячка, а опромінені – клітини будь-якого ссавця зокрема. людини. Якщо припустити, що це людські клітини, вони піддаються впливу дуже високих доз γ-радіації і така клітина стає нежиттєздатною, ми отримуємо клітину із серйозно фрагментованою ДНК і репарувати такі хромосоми неможливо. Якщо таку клітину злити з клітиною іншого ссавця, то система репарації неушкодженої клітини намагатиметься репарувати ці двониткові розриви і результатом буде випадкові включення фрагментів цієї ДНК в різні ділянки своїх неушкоджених хромосом. Те, що не вдалося включити при розподілі клітини буде еліміновано, а те, що включилося, буде стандартно успадковуватися в цій клітинній лінії. Оскільки в кожну хромосому включається кілька фрагментів чужорідної ДНК при правильній дозі радіації, достатньо близько 100 клітин ста ліній таких гібридом для того, щоб побудувати докладну STS-карту еукаріотичного геному.
За допомогою ПЛР зафіксується наявність маркерів в одному зразку ДНК та обчислюється частота знаходження цих маркерів у всіх варіантах ліній. Існують різні механізми автоматизації.
Суть його зводиться до того що, що з детекції використовується не електрофорез, а флуоресцентна мітка, причому ця мітка досить хитро сюди включається. Флуоресцентні нуклеотиди додаються до реакції, але система детекції здатна вловлювати тільки поляризований сигнал, спочатку сигнал не поляризований – детекція не йде. Ситуація включається при включенні такого нуклеотиду до ДНК. Ці нуклеотиди є термінуючими, тому вони включаються тільки один раз і після включення флуоресцируют трохи по-іншому. Робиться ПЛР, якщо продукт присутній додається ще один внутрішній праймер; він гібридизується з одним із ланцюжків продукту і до нього приєднується цей нуклеотид. Після цього сигнал виявляється поляризованим і його можна детектувати. Якщо продукту немає – сигналу не буде. З такою модифікацією ПЛР детекції можна у масштабах еукаріотичного геному досить швидко побудувати фізичну карту геному.
Коли ми почали розмовляти про sts-картування, я говорив, що другий варіант джерела фрагментів для картування є лише стандартною клонотекою. Вона трохи менш зручна в тому плані, що набагато більше клонів доводиться використовувати, нижче виходить частота спільного знаходження на одному фрагменті, але скринінг виходить більш протяжний. Але, є переваги, які принаймні частково компенсують цей недолік, вони полягає в тому, що одні і ті ж клони можна використовувати і для побудови карти і ті ж клони можна потім брати для секвенування. Одну й ту ж клонотеку можна використовувати для картування, а потім для визначення нуклеотидної послідовності, тому тут не треба спеціально щось конструювати, а вже наявну клонотеку можна використовувати для такого картування.
Ну вам може бути розповідали коли була цитологія, про принцип fluorescence assisted cell sorting, тобто фарбування цих клітин іде флуоресцентним барвником, тобто дуже невелика модифікація цієї методики дозволяє відкривати не клітини, а хромосоми. І цей принцип дозволяє розділити весь хромосомний набір на окремі хромосоми і потім, бібліотеки робляться з ДНК однієї хромосоми. Це колосальна допомога тому, що одна справа працювати в масштабі геному розміром 3 млрд нуклеотидних пар, інша справа в масштабі однієї хромосоми, тоді в нас вийде в середньому 150 млн. Ви відчуваєте, як падають масштаби і природно цей метод використовується. Я сподіваюся, що ви це добре пам'ятаєте, тут усе дуже просто. Те, що потрібно сортувати, фарбується флуоресцентним барвником, у разі хромосоми. Кількість барвника, який зв'язується з хромосомою, залежить від декількох факторів, в першу чергу від розміру хромосоми – це основний фактор, та й у другу чергу – це структура білків, які пов'язані з цією хромосомою. Білки трошки різняться, в першу чергу різняться кількістю гетерохроматину, ну це визначає те, що немає прямої кореляції між розміром хромосоми та інтенсивністю фарбування. Ну, що відбувається потім, потім розчин капається з пробірки маленькими краплями, кожна концентрація підібрана таким чином, щоб крапля була порожньою, або містила одну хромосому, ні в якому разі не дві. Потім крапля збоку висвітлюється променем лазера, і якщо у краплі є хромосома, то збуджується флуоресценція, флуоресценція детектується детектором. Інтенсивність флуоресценції пропорційна кількості барвника, що зв'язався. Ця кількість характеризує кожну хромосому унікальним чином, на цій стадії можна сказати, яка хромосома в цій краплі знаходиться. Потім ця пара електродів відповідно до інтенсивності флуоресценції заряджає краплю так, що виходить досить потужне електричне поле. Чим більша флуоресценція, тим більше заряд краплі повідомляється. Крапля летить далі, пройшовши через наступну пару електродів. Ці електроди відхиляють краплю праворуч або ліворуч відповідно до заряду. Чим більший заряд, тим більше буде відхилення в один бік, в один бік вона загалом відхилятиметься і відповідно кожна хромосома капатиме в свою пробірку. Правильний підбір барвника у разі хромосом людини дозволяє таким чином розкопати все, крім однієї пари хромосом, по окремих пробірках. Для пари хромосом, що залишилася, беруть інший барвник, який трохи інакше зв'язується і цю пару теж можна розділити. Таким чином, ми отримуємо з тотального препарату ДНК препарати окремих хромосом, що спрощує подальшу роботу. На цьому ми з картуванням та бібліотеками закінчуємо.
Генетичне картування досі використовується і використовуватиметься т.к. Крім складання карт геному у нього є важливе застосування - є методика маркерсистованої селекції, яка дозволяє дуже швидко вводити потрібний ген.
Генотип такого нового сорту з дикого чітко контролює присутність цього гена по молекулярному маркеру. Нестача полягає в обмеженій точності. для E.coli та дріжджів генетичне картування йшло з 50х рр. і була картована тисяча генів. У разі E.coli та дріжджів максимальна щільність таких карт один ген на 3тис.н.п. у E.coli та один ген на 10 тис.н.п. у дріжджів. І в тому і в іншому випадку виходить що вдається картувати лише кожен третій, кожен четвертий ген. Більшої точності досягти не виходить. Друга проблема пов'язана з тим, що кросинговер йде нерівномірно по довжині хромосоми, є гарячі точки кросинговера, є ділянки хромосоми які блокують кросинговер - це вносить додаткову помилку і може змінити позиції деяких локусів на генетичній карті. Також через неакуратність збільшується кількість експериментальних помилок.
У картування 2 завдання – визначити відносне розташування якихось ділянок на хромосомі, а друге завдання – визначити відстань між ними. Тобто. щодо відносного розташування ген картування більш-менш справляється з цим, якщо подивитися на слайд позиції цих маркерів збігаються, крім двох вони переставлені місцями, очевидно тут є якась аномалія. Що стосується відстані між маркерами, то тут вже дещо гірше – ви бачите, що деякі відстані виявляються дещо більшими, деякі дещо меншими за реальні відстані. Відповідно зараз все більше і більше значення набувають методики фізичного картування, які зараз є невід'ємною частиною геномного проекту як при класичному підході до секвенування, так і при шотган підході, тому що в більшості випадків для ліквідації прогалин на стадії фінішування все одно без картки не обійтися, особливо еукаріотичних геномів.
Картування генів- Визначення положення даного гена на будь-якій хромосомі щодо інших генів. Використовують три основні групи методів картування генів – фізичне (визначення за допомогою рестрикційних карт, електронної мікроскопії та деяких варіантів електрофорезу міжгенних відстаней – в нуклеотидах), генетичне (визначення частот рекомбінацій між генами, зокрема, у сімейному аналізі та ін.) та цитогенетичне ( гібридизації in situ, отримання монохромосомних клітинних гібридів, делеційний метод та ін.). У генетиці людини прийняті 4 ступеня надійності локалізації даного гена - підтверджена (встановлена в двох і більше незалежних лабораторіях або на матеріалі двох і більше незалежних тест - об'єктів), попередня (1 лабораторія або 1 аналізована сім'я), суперечлива (несупад даних різних дослідників), сумнівна (не уточнені дані однієї лабораторії).
Генетичне картування передбачає визначення відстаней частоти рекомбінацій між генами. Фізичне картування використовує деякі методи молекулярної генетики визначення відстані в нуклеотидах. Генетичне картування - це визначення групи зчеплення і положення гена, що картується, щодо інших генів даної хромосоми.
Чим більше генів відомо у цього виду, тим точніше результати цієї процедури. Як правило, кількість генів у групах зчеплення залежить від лінійних розмірів відповідних хромосом. Однак, протяжні області конститутивного гетерохроматину (в районі центроміри та тіломірних ділянок) практично не містять генів і, таким чином, порушують цю залежність.
На першому етапі картування визначають належність гена до тієї чи іншої групи зчеплення. Як відомо, у D. melanogaster у диплоїдному наборі чотири пари хромосом: перша пара – статеві хромосоми (XX – у самок, XY – у самців), друга, третя та четверта – аутосоми. Число генів у Y-хромосомі самців дуже мало. Для локалізації новоствореної мутації необхідно розташовувати набором маркерних генів для кожної хромосоми. Картування мутації полягає в аналізі її зчеплення з цими маркерами. Наприклад, якщо мутація, що нас цікавить, успадковується незалежно від маркерів другої хромосоми, робиться висновок про її приналежність до іншої групи зчеплення.
Про значення картування генів, і в першу чергу генів людини, говорить створення Міжнародної програми "Геном людини", яка ставить перед собою грандіозне завдання картувати всі гени людини та секвенувати повністю всю ДНК геному. Програма розробляється у сотнях лабораторій у багатьох країнах світу. Використовуються методи молекулярної біології, цитогенетики та генетики соматичних клітин. Розроблено критерії, що визначають достовірність картування. Визначено різні рівні достовірності локалізації гена.
Важливим внеском у розвиток генетики стала хромосомна теорія спадковості, розроблена насамперед завдяки зусиллям американського генетика Томаса Ханта Моргана та його учнів та співробітників, які обрали об'єктом своїх досліджень плодову мушку. Drosophila melanogaster. Вивчення закономірностей зчепленого наслідування дозволило шляхом аналізу результатів схрещувань скласти карти розташування генів у «групах зчеплення» та зіставити групи зчеплення із хромосомами (1910-1913 рр.).
