Современные методы картирования геномов. Картирование и определение первичной структуры генома человека Методы картирования генов типы генных карт
Важнейшей задачей молекулярной генетики применительно к медицине является идентификация генов наследственных заболеваний человека и выявление конкретных повреждений в них, приводящих к развитию фенотипических проявлений болезни. Эта задача может пить выполнена с помощью нескольких основных под-
\ОДОВ.
Первый подход к идентификации генов, остававшийся ведущим приблизительно до начала 90-х годов,
| чзируется на имеющейся информации об основном био- х11 мическом дефекте (первичном белковом продукте гена), ха- рактеризующем изучаемую болезнь | Шишкин С.С., Калинин В.Н., ] 992; Gardner Е. et al., 1991; Collins F., 1995].
I l"-реход от белкового анализа на уровень ДНК осуществлялся через секвенирование очищенного белкового продукта и получение ДНК-зондов, использование моноклональных антител и с помощью некоторых других методических приемов. Хромосомная локализация гена в данной схеме поиска является конечным результатом исследования. Описанный подход, использующий ту или иную предварительную информацию о функциональном значении искомого гена, получил название «функциональное клонирование» . Примером успешного применения функционального клонирования является идентификация гена фенилкетонурии. К сожалению, данный метод может быть применен лишь к весьма ограниченному кругу заболеваний человека, тогда как для большинства наследственных болезней первичные продукты гена или патогномоничные биохимические маркеры неизвестны.
Совершенствование молекулярных технологий привело к созданию принципиально иной стратегии поиска гена, не требующей каких-либо предварительных знаний о его функции или первичном биохимическом продукте. Данная стратегия предполагает идентификацию гена на основании точного знания его локализации в определенном хромосомном локусе - «позиционное клонирование» (менее удачный термин «обратная генетика») . Позиционное клонирование ведет к установлению молекулярной основы болезни «от гена к белку» и включает следующие основные этапы: 1) картирование гена болезни в определенном участке конкретной хромосомы (генетическое картирование); 2) составление физической карты изучаемой хромосомной области (физическое картирование); 3) идентификация экспрессирующихся последовательностей ДНК в изучаемой области; 4) секвенирование генов-кандидатов и выявление мутаций в искомом гене у больных лиц; 5) анализ структуры гена.
расшифровка последовательности и первичной структуры его продуктов - мРНК и белка . В ряде случаев позиционное клонирование гена облегчается при обнаружении у больных видимых ци го- генетических перестроек или определяемых делеций в критической хромосомной области, позволяющих значительно повысить точность картирования мутантного гена. Выявление таких перестроек способствовало, в частности, успеху в клонировании генов миодистрофии Дюшепна/Бекера, нейрофиброматоза 1-го типа, туберозного склероза, адренолейкодистрофии и других наследственных заболеваний нервной системы.
Одним из важных промежуточных результатов исследовательского прост а «Геном человека» стало со- здапие все более и более насыщенной транскрипционной карты генома, содержащей сведения о тысячах уже известных генов и экспрессирующихся нуклеотидных последовательностей. Это способствовало значительному развитию еще одного подхода к идентификации первичного генетического дефекта, при котором после предварительного картирования мутантного гена проводится скрининг подходящих генов-кандидатов, расположенных в том же хромосомном участке (lt;lt;positional candidate approach») . Данный метод предполагает наличие определенных знаний о патофизиологии изучаемого заболевания, что дает возможность проводить рациональный отбор гепов-кандидатов для анализа из большого числа генов, которые могут быть расположены в «зоне интереса». Среди неврологических наследственных заболеваний, гены которых были идентифицированы таким образом благодаря анализу подходящих кандидатов в установленном хромосомном интервале, можно назвать дофа-зависимую дистонию и фридрейхо- подобную атаксию с дефицитом витамина Е. По существующим прогнозам, именно анализ «позиционных кандидатов» станет в ближайшем будущем ведущим методом идентификации генов наследственных болезней, чему в немалой степени способствует создание и постоянное расширение компьютерных баз данных экспрессирующихся последовательностей на хромосомах («expressed sequence tags») .
Таким образом, определение хромосомной локализации искомого гена - генетическое картирование - является первым, ключевым шагом на пути к раскрытию молекулярной основы того или иного наследственного заболевания.
Существует несколько основных методов, позволяющих картировать неизвестный ген в конкретном хромосомном локусе: а) клинико-генеалогический (простейший и наиболее давний) - основан на анализе наследования признаков в больших родословных; примером может служить установление локализации гена на Х-хро- мосоме в случае передачи болезни по Х-сцепленному типу; б) цитогенетический - базируется на ассоциации выявляемых при микроскопии хромосомных перестроек с определенным клиническим фенотипом; в) метод гибридизации in situ (в том числе его современная модификация - флюоресцентная гибридизация in situ, FISH) - использует специфическую гибридизацию мРНК и кДНК искомого гена с денатурированными хромосомами на метафазных препаратах клетки; г) метод гибрид ных клеток - основан на анализе совместной сегрегации клеточных признаков и хромосом в клонированных in vitro гибридных соматических клетках [Фогель Ф., Мотульски А., 1990; Gardner Е. et al., 1991]. Все эти методы нашли свое применение в современной молекулярной генетике, однако они обладают серьезными ограничениями, связан ными как с недостаточной разрешающей способностью, так и с существованием жестких предусловий, необходимых для проведения исследования (таких как наличие зондов, доступность селективных систем для отбора гибридных клеток и т.п.). Наиболее мощным, продуктивным и широко используемым в настоящее время методом картирования генов наследственных болезней человека является так называемый linkage-анализ - анализ сцепления искомого гена с набором точно локализованных генетических маркеров .
Центральное положение linkage-анализа заключается в том, что мерой относительного генетического расстояния между двумя локусами па хромосоме может служить частота рекомбинаций между этими локусами в результате кроссинговера гомологичных хромосом в мейозе. Чем ближе расположены локусы па хромосоме, I ем больше вероятность того, что они будут наследоваться как единое целое (группа сцепления); при значительной удаленности изучаемых локусов (т.е. слабой степени сцепления) они с большей вероятностью разойдутся после кроссинговера по разным хромосомам. Частота рекомбинации между локусами 1% принята за единицу
- енетического расстояния между ними - 1 сантиморга- ниду (сМ), что эквивалентно в среднем 1 миллиону п.о. Следует подчеркнуть, что частота рекомбинаций и, следовательно, генетическое расстояние, неодинаковы для мужчин и женщин (больше у женщин), для разных хромосом, а также для разных участков одной хромосомы («горячие точки» рекомбинации) .
Рис. 30. Принцип анализа генетического сцепления на примере аутосомно-доминантного заболевания В данном примере исследованы 4 сцепленных маркера А, В, С и D, по которым реконструированы гаплотипы. Разные по происхождению хромосомы маркированы различными типами штриховки (исходная мутантная хромосома обозначена черным цветом). Все больные в родословной имеют одну и ту же общую (среднюю) часть исходной мутантной хромосомы. Например, в нижнем поколении хромосомы претерпели ряд рекомбинаций, однако у всех больных сибсов (в том числе у лиц Ш-З и Ш-8) сохраняется один и тот же мутантный гаплотип по маркерам В и С (гаплотип у). Напротив, никто из здоровых сибсов в нижнем поколении не унаследовал от отца гаплотип j по маркерам В и С (индивидуум Ш-4 унаследовал хромосому, в которой рекомбинация произошла ниже критического сегмента). Таким образом, сегрегация маркерных аллелей и анализ гаплотипов свидетельствуют о том, что ген заболевания расположен в хромосомном сегменте, включающем в себя маркеры В и С. Соответственно, внешними границами участка хромосомы, в пределах которого расположен мутантный ген, являются маркеры А и D.
и тот же аллель исследуемого маркера, это свидетельствует об отсутствии рекомбинаций между искомым мутантным геном и данным маркером, т.е. о наличии сцепления между ними. Пример сцепления между геном аутосомно-доминантного заболевания и определенными генетическими маркерами представлен на рис. 30.
Для достоверного доказательства сцепления разработан специальный математический аппарат . Принцип расчета заключается в сопоставлении вероятностей гипотез о наличии и отсутствии сцепления при имеющихся семейных данных и выбранной частоте рекомбинаций 0; соотношение этих двух вероятностей (соотношение правдоподобий) выражает шансы за и против сцепления. Для удобства используется десятичный логарифм соотношения правдоподобий - Лод- балл (от англ. Logarithm of the Odds, или LOD):
Po
LOD = Logio --
P1/2 , где P - вероятность
полученного распределения семейных данных для сцепленных генов с частотой рекомбинаций 0, Р - вероятность такого распределения для двух несцепленных свободно рекомбинирующих генов (частота рекомбинаций 0 = 1/2). Использование логарифмической формы расчета позволяет проводить сложение 27од-баллов, полученных при анализе отдельных родословных. Для доказательства генетического сцепления принято значение Лод- балла +3, которое означает соотношение шансов 1000:1 в пользу наличия генетического сцепления междgt; маркером и изучаемым признаком. Лод-балл -2 и ниже свидетельствует о достоверном отсутствии сцепления; значения Лод-балла от +3 до - 2 являются, соответственно, более или менее предположительными с точки зрения наличия сцепления и нуждаются в дальнейшем подтверждении. Частота рекомбинаций 0, для которой был выявлен максимальный Л од-балл, является отражением наиболее вероятного генетического расстояния между изучаемыми локусами; ориентировочно считается, что 1% рекомбинаций свидетельствует об очень тесном сцеплении, частота рекомбинаций около 5% - о хорошем сцеплении и частота 10-20% - о некотором умеренном сцеплении.
Расчет Лоб-баллов предполагает использование специального компьютерного программного обеспечения (программа LIPED, пакет программ LINKAGE и др.) .
Для успеха linkage-анализа необходимо, чтобы исследуемые семьи были информативны по болезни и по генетическому маркеру. Первое означает наличие достаточного числа информативных мейозов в родословной, позволяющих анализировать расхождение признаков в данной родословной. С практической точки зрения это означает наличие большого числа доступных для анализа больных и здоровых родственников, как правило, из нескольких поколений. Информативность по маркеру предполагает его полиморфизм (т.е. существование большого числа аллелей) и гетерозиготность у ключевых членов семьи, что позволяет дифференцировать генетическое происхождение конкретных аллелей маркера. До конца 80-х годов основным типом маркеров, используемых в анализе сцепления, были участки ДНК хромосом, имеющие в своем составе вариацию в одной паре оснований и различаемые по наличию или отсутствию участка рестрикции для соответствующего фермента, т.е. по длине рестрикционных фрагментов («restriction fragment length polymorphism», RFLP) . Новая эра в генетическом картировании наступила с открытием класса высокополиморфных маркеров, представляющих собой участки ДНК, состоящие из вариабельного числа копий тандемных (СА)п-повторов и обладающие чрезвычайно высокой гетерозиготностью . Это позволило в значительной степени разрешить проблему информативности используемых маркеров и способствовало существенному прогрессу linkage-анализа. По некоторым оценкам, для скрининга полного гаплоидного генома и выявления генетического сцепления необходимо иметь 200-300 высокополиморфных маркеров, равномерно распределенных по хромосомам . Генетические карты последнего поколения включают свыше 5000 таких маркеров , что позволяет считать сегодня задачу установления генетического сцепления принципиально возможной в любых информативных родословных .
Серьезных проблемой, с которой приходится сталкиваться при проведении анализа сцепления на серии семей, является проблема возможной генетической гетерогенности изучаемого клинического синдрома. В случае, если изучаемый фенотип может вызываться мутациями в разных генах, механическое сложение полученных в отдельных семьях положительных (при наличии сцепления) и отрицательных (при его отсутствии) Лод- баллов ведет к нивелированию суммарного значения Лод- балла и ложному выводу о полном отсутствии сцепления. Примером может служить аутосомно-доминантная моторно-сенсорная невропатия 1 типа, обусловленная мутациями в разных генах, локализованных на 1-й, 17-й и других хромосомах . В этой ситуации особое значение приобретает тщательное, детальное обследование больных и семей, направляемых для linkage-анализа, с целью отбора максимально однородных клинических групп. Дополнитеёгьным способом избежать ложно-отрицательного результата исследования является использование в процессе расче
та,/7од-баллов специальной программы HOMOG или аналогичных ей программ, позволяющих оценивать вероятность генетической гетерогенности при полученном конкретном наборе семейных данных . Наиболее действенным подходом на первом этапе исследования является анализ сцепления в одной большой информативной родословной, что позволяет заведомо иск почить возможность генетической гетерогенности в изучаемой группе больных. Дополнительные сложности при проведении linkage-анализа связаны с нередко наблюдающейся неполной пенетрант- ностью и вариабельной экспрессивностью мутантного гена, наличием фенокопий среди обследуемых членов семьи, оценкой возраста начала болезни и возможности доклинического носительства мутации, оценкой распространенности конкретных аллелей изучаемых маркеров в популяции и т.д. . Неверный учет или недооценка этих факторов могут существенно повлиять на итоговый результат, поэтому качество подробного клинико-генеалогического анализа в изучаемых семьях выступает на первый план.
Разработано много новых методов, представляющих из себя дальнейшее развитие традиционной стратегии исследования генетического сцепления и существенно повышающих скорость выполнения, методические возможности и разрешающую способность данного анализа в локализации неизвестных генов наследственных заболеваний человека. Одним из таких методов является мультилокусный анализ (multipoint linkage analysis), позволяющий оценивать Лод-баллы для совокупности сцепленных локусов в соответствии с генетической картой изучаемого хромосомного участка и определять наиболее вероятную локализацию мутантного гена в пределах данного участка . В инбредных
родословных с аутосомно-рецессивным заболеванием при наличии предположения об «эффекте основателя» исключительно продуктивным зарекомендовал себя метод гомозиготного картирования: он заключается в анализе «го- мозиготности по происхождению» {«homozygosUy-by- descent») и позволяет оценить степень гомозиготлости больных лиц по серии маркеров как результат наследования от единого предка общего хромосомного участка, включающего мутантный ген . Многообещающим является метод «экономного сканирования генома», предполагающий преимущественное использование маркеров, локализованных в «стратегических» CG насыщенных хромосомных областях, богатых экспрессирующимися последовательностями . Предложен также целый ряд других модификаций классического linkage-анализа .
Важно подчеркнуть, что анализ сцепления сохранит свое значение и после идентификации всего генома человека . Например, при изучении все еще достаточно большой группы наследственных заболеваний с неустановленными генами первым шагом на пути к выяснению молекулярного дефекта может служить /ш/ш^е-апализ и определение хромосомного локуса болезни, с последующим скринингом подходящих генов в данной области. Чрезвычайно важной в успехе генетического картирования является роль клинициста. Она заключается в адекватном отборе репрезентативных семей, детальной оценке клинического статуса всех включенных в исследование членов семьи, точной диагностике болезни и оценке характера сегрегации мутантного гена, а также в решении многих других ключевых вопросов.
Картирование генов gene mapping, mapping - картирование генов.
Oпределение положения данного гена на какой-либо хромосоме относительно других генов; используют три основные группы методов К.г. - физическое (определение с помощью рестрикционных карт, электронной микроскопии и некоторых вариантов электрофореза межгенных расстояний - в нуклеотидах), генетическое (определение частот рекомбинаций между генами, в частности, в семейном анализе и др.) и цитогенетическое (гибридизации in situ <in situ hybridization >, получение монохромосомных клеточных гибридов <monochromosomal cell hybrid >, делеционный метод <deletion mapping > и др.); в генетике человека приняты 4 степени надежности локализации данного гена - подтвержденная (установлена в двух и более независимых лабораториях или на материале двух и более независимых тест-объектов), предварительная (1 лаборатория или 1 анализируемая семья), противоречивая (несовпадение данных разных исследователей), сомнительная (не уточненные окончательно данные одной лаборатории); в Приложении 5 приведена сводка (по состоянию на 1992-93) структурных генов, онкогенов и псевдогенов в геномах человека и - включая некоторые мутации - мыши.
(Источник: «Англо-русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд-во ВНИРО, 1995 г.)
Смотреть что такое "картирование генов" в других словарях:
картирование генов - Определение положения данного гена на какой либо хромосоме относительно других генов; используют три основные группы методов К.г. физическое (определение с помощью рестрикционных карт, электронной микроскопии и некоторых вариантов электрофореза… …
Картирование генов - определение положения данного гена на какой либо хромосоме относительно других генов. Генетическое картирование предполагает определение расстояний по частоте рекомбинаций между генами. Физическое картирование использует некоторые методы… … Словарь по психогенетике
картирование [генов] с помощью бэккроссирования - Генетический метод картирования, основанный на получении бэккроссных гибридов родственных форм и анализе расщепления вариантов аллелей, полиморфных по длинам рестрикционных фрагментов; наиболее распространен данный метод в картировании генов у… … Справочник технического переводчика
Backcross mapping картирование [генов] с помощью бэккроссирования. Генетический метод картирования, основанный на получении бэккроссных гибридов родственных форм и анализе расщепления вариантов аллелей, полиморфных по длинам рестрикционных… …
Картирование сравнительное генов млекопитающих - * картаванне параўнальнае генаў млекакормячых * comparative mapping of mammalian genes информативное сопоставление генетических карт человека и любого из др. видов млекопитающих). Они должны быть одновременно хорошо изучены и далеко отстоять друг …
Картирование - * картаванне * mapping установление позиций генов или каких то определенных сайтов (см.) вдоль нити ДНК (. Карта) … Генетика. Энциклопедический словарь
Картирование с помощью облученных гибридов [клеток] - * картаванне з дапамогай апрамененых гібрыдаў [клетак] * radiated hybrid mapping модификация метода картирования генов с использованием гибридизации соматических клеток. Клетки гибридного клона «грызун Ч человек», содержащие только хромосому 1… … Генетика. Энциклопедический словарь
Radiation hybrid mapping картирование с помощью облученных гибридов [клеток]. Модификация метода картирования генов с использованием гибридизации соматических клеток клетки гибридного клона “грызун ˟ человек”, содержащие только 1 хромосому… … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.
Установление порядка расположения генов и относительного расстояния между ними в группе сцепления … Большой медицинский словарь
1.1. При цитологическом картировании изучение дифференциально окрашенных хромосом позволяет обнаружить крупные хромосомные перестройки путем сравнения исследуемого образца с контрольным.
1.1.1. Гибридизация in situ: ISH- и FISH- гибридизация
Прямым методом картирования генов на хромосоме является метод гибридизации нуклеиновых кислот. Вариации метода (гибридизация in situ - на месте) и FISH используются в тех случаях, когда имеются пробы, или зонды с известными (секвенированными) нуклеотидными последовательностями. Зонды - это искусственно синтезированные меченые: радиоактивными изотопами или флуоресцентными красителями - химически небольшие (10-30 нуклеогидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК), комплементарные искомому гену. Эти короткие олигонуклеотиды соединяются только с тем участком ДНК, который содержит последовательность нуклеотидов, строго соответствующую (комплементарную) последовательности нуклеотидов зонда. Следовательно, наличие связавшейся с ДНК метки с высокой точностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых последовательностей нуклеотидов.
Локусы генов, комплементарные зондам, могут быть картированы непосредственно на хромосоме путем регистрации радиоактивной метки.
1.1.2. Хромосомный пейнтинг
Одним из наиболее разрешающих методов является многоцветная флуоресцентная гибридизация или хромосомный пейнтинг (хромосомная живопись). Для получения многоцветных изображений используют различные флуорохромы, которыми метят разные зонды ДНК. Информация об интенсивности свечения каждого флуорохрома записывается на компьютере отдельно и каждому из таких изображений присваивается свой собственный псевдоцвет.
1.1.3. Гибридизация соматических клеток
При цитологическом картировании используется также гибридизация соматических теток. В условиях культуры можно получить соматические гибриды клеток человека и различных грызунов: человек - мышь, человек - крыса, человек - хомяк. Так, к 2002 году был полностью изучен геном мыши. Оказалось, что многие гены в геноме мыши гомологичны по структуре генам человека.
1.2. Генетическое картирование
Генетические карты - это карты-схемы взаимного расположения генов на индивидуальных хромосомах, т.е. находящихся в одной группе сцепления.
Принципы генетического картирования были впервые разработаны Т. Морганом. Им же была составлена первая генетическая карта X-хромосомы дрозофилы, основанная на учете частоты образования кроссоверных и некроссоверных гамет у самок, гетерозиготных по рецессивным мутациям, локализованным в Х-хромосоме. Так. в мейозе гетерозиготных самок кроссинговер между генами у (желтое тело) и w- (белые глаза) происходил в 1,5% случаев, между генами w и m (миниатюрные крылья) -34,5%, а между генами у и т - 36% случаев.
Генетические карты сцепления правильно отражают порядок расположения генов (или генетических маркеров) на хромосомах, однако расстояния между ними имеют относительные значения, т.е. не соответствуют реальным физическим расстояниям.
1.3 . Молекулярные маркеры ДНК и их использование для генетического картирования
1.3.1. ПДРФ - маркеры ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК,
Было установлено, что генетическим маркером может быть любое место в геноме, где произошло изменение в последовательности ДНК, которое обнаруживается как внутреннее различие между индивидами в популяции, но никаких внешних (фенотипических; различий между ними при этом не наблюдается.
У бактерий установлен и выделен целый ряд ферментов рестриктаз, которые узнают специфические последовательности в молекуле ДНК (обычно составляющие 4-6 нуклеотидов) и разрезают двойную спираль внутри или вблизи сайта узнавания, в результате чего образуются рестрикционные фрагменты, или рестрикты.
Отсутствие сайта узнавания может быть связано с делецией. инсер-цией или заменой нуклеотидов. Следовательно, любая мутация, изменяющая последовательность нуклеотидов сайта рестрикции, уничтожает этот сайт.
1.3.2. Молекулярные маркеры, основанные на полимера гной цепной реакции (ПЦР-маркеры)
Принципы метода ПЦР. Полимеразная цепная реакция имитирует природный процесс воспроизведения (удвоения) ДНК - репликацию, происходящую на матричной основе (по принципу комплементарности) с участием фермента ДНК-полимеразы. Но если во время репликации удваивается вся ДНК, то при ПЦР - происходит многократное копирование (воспроизведение, амплификация) лишь интересующего исследователя специфического, небольшого фрагмента, расположенного между двумя праймерами.
1.3.3. Микросателлиты и минисателлиты как молекулярные маркеры
Разновидностями сатДНК являются.микросателлиты (МКС, или простые повторяющиеся последовательности - ППП) и минисателлиты (МНС). Минимальная повторяющаяся единица (КОР) микросателлитов включает от 1 до 10 пар нуклеотидов, минисателлитов - 15 -70 пн. Их расположение в геноме и число повторений коровых единиц специфичны для каждого организма.
1.4. Физическое картирование
Физическое картирование основано на прямом анализе молекул ДНК. составляющих каждую хромосому (без анализа результатов скрещивания). Его конечная цель -определение последовательности нуклеотидов в каждой хромосоме
1.4.1. Создание рестрикционных карт
Рестрикционное картирование основано на установлении точек действия различных рестриктаз. Распределение сайтов рестрикции представляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и может использоваться для его идентификации.
Банк генов. Для этого фрагменты ДНК организма присоединяют к векторным молекулам, т.е. молекулам-переносчикам чужеродных генов. В качестве векторов используют плазмиды бактерий, фаги (вирусы, инфицирующие бактерии), космиды (гибридные молекулы, полученные из ДНК фага К и бактериальной плазмиды; благодаря наличию cos-участка фага А., который обеспечивает замыкание его линейной ДНК в кольцо, космидная ДНК, включившая чужеродные гены, может быть упакована в головку бактериофага). В качестве векторов используют также искусственные хромосомы дрожжей YAK - (ЯК) и бактерий ВАС - (БАК) хромосомы.
1.4.2. Создание упорядоченных библиотек клонов. Карты контиг.
Процедура "Прогулка по хромосоме"
Чтобы установить порядок расположения клонов (т.е. клонированных фрагментов ДНК) на хромосоме (по ее длине), необходимо выявить участки их частичного перекрывания. Это можно сделать путем гибридизации нуклеиновых кислот, если известна нуклеотидная последовательность хотя бы одного фрагмента. Его метят радиоактивно или флуорохромом и используют в качестве зонда для создания упорядоченных библиотек клонов.
"Прогулка по хромосоме" (скользящее зондирование). Для упорядочивания клонов используют две разные библиотеки геномной ДНК, полученные из ДНК одного и того же организма, но разделенные двумя разными рестриктазами. Если один из генов (или клонов) в первой библиотеке удалось картировать и клонировать (т.е. получить из него ДНК-маркирующий сайт - STS), он затем может быть использован в качестве зонда для выявления перекрывающегося клона во второй библиотеке. А изученный клон второй библиотеки может использоваться как зонд для другого перекрывающегося фрагмента первой библиотеки и т.д.
Таким образом устанавливается порядок расположения клонов на хромосоме.
1.4. Определение нуклеотидной последовательности генома (секвенирование ) Исчерпывающая физическая карта генома человека (и любого другого организма) должна представлять собой полную последовательность нуклеотидов ДНК всех его хромосом.
1.5. Кандидатное картирование
В рамках этих подходов картировать ген означало пройти путь от его функции к локализации на хромосоме (позиции).
Картирование – самый простой способ состыковать контиги.
Картирование геномов может быть генетическое и физическое.
Генетическое картирование:
Содержит ген – фенотипический маркер;
Молекулярные маркеры:
RFLP (полиморфизм длин рестрикиционных фрагментов) –это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикций (расщепляют нуклеиновые кислоты в середине) и дальнейший анализ образовавшихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза;
SSLP (полиморфизм длин простых повторов)- Их есть 2 типа: минисателлиты и микросателлиты. Микросателлиты – повтор 2,3,4 н.п. Это ошибки в работе ДНК-полимеразы. Когда есть участок, где много раз повторяется олигонуклеотид, есть вероятность проскальзывания ДНК-полимеразы. Она с определенной долей вероятности может диссоциировать с матрицей и присоединиться к соседнему повтору. В результате при репликации будет либо на один повтор больше, либо на один меньше;
SNP (Полиморфизм по одиночным нуклеотидам) – отличия последовательности ДНК размеров в 1 нуклеотид в геноме представителя одного вида;
Детекция молекулярных маркеров:
1. Гибридизация ДНК:
1.1. Зонды будут спариваться с одноцепочечной ДНК, образуются полные или неполные комплементы.
1.2. Электрофорез в ПАА. Перенос с помощью нитроцеллюлозной бумаги. Радиомеченные пробы гибридизуются с ДНК. Выявляются авторадиографически.
Используется для детекции молекулярных маркеров:
1. Повторяющихся локусов;
2. Полиморфизм рестрикционных фрагментов (ПДРФ, RFLP) – обработка рестриктазой.
Типы повторов:
1. Короткие (2-4 н.) полиморфизм длин простых последовательностей (SSLP);
2. Минисателлиты (до 25 н.) VNTR;
3. Микросателлиты (ди- или тетрануклеотиды) STR, SSR;
Полиморфизм по одиночным нуклеотидам в агарозном геле (SNP);
(AGTCAG AAATC);
(AGTCAC AAATC);
Использование ДНК-чипов методом фотолитоавтографии.
Стеклянная подложка обрабатывается, на неё наносится нуклеотид. 5’-конец блокируется, освещение лазером удаляет блокирующую группировку. Так можно нанести сотни тысяч зондов.
Негибридизующиеся фрагменты отмываются; определяется по пятнам (от флуоресцентно меченной ДНК).
Недостатки:
1. Ограниченная разрешающая способность (максимум 1 ген на 3.3 кн. у E. coli и 1 ген на 10 кн. У S. cerevisiae);
2. Ограниченная разрешающая способность из-за неравномерности кроссинговера.
Основные методы физического картирования:
1. Рестрикционное картирование;
2. FiSH (флуоресцентная гибридизация in situ);
3. Картирование STS;
Рестрикционное картирование – это определение относительного расположения и определенных сайтов рестрикции на геномной карте и определение расстояний между ними.
Особенности крупных участков:
1. Использование рестриктаз, распознающих 7-8 н.;
2. Использование рестриктаз, в сайт распознавания которых входят редкие комбинации нуклеотидов;
3. Использование специальных методик гель-электрофореза с переменным электрическим полем для разделения крупных фрагментов ДНК.
Классическим походом является электрофорез для определения размеров фрагментов. Нужно как минимум 2 рестриктазы, каждая из них обрабатывает исследуемый фрагмент ДНК.
Первое что нужно сделать это подобрать рекстриктазу которая разрезает реже, чтоб получилось разумное число фрагментов. Здесь вот статистически рассчитанная частота встречаемости сайтов для различных эндонуклеаз с разным размером сайта. Берутся рестриктазы которые имеют самый длинный сайт, плюс подбираются специально еще такие рестриктазы в сайтах которых есть редкие комбинации нуклеотидов. Таким образом мы получаем реакцию рестрикции с разумным количеством фрагментов, но нужно все равно определить размер этих фрагментов. Для того чтобы определить размер крупных фрагментов используются специальные методики: либо электрофорез в переменном поле, либо другие способы визуализации которые объединяются под названием оптическое картирование.
Первое – таким образом можно найти можно найти ферменты, которые будут еще реже резать. В частности на примере генома человека, этот сайт показывает почему у нас мало CG комбинаций. В геноме человека CG буквы расположены рядом встречаются только в промоторных областях. Соответственно в большей части генома они не присутствуют. Почему так происходит? Потому что цитозин метилируется, т.е. происходит присоединение метильной группы. Был цитозин, получился 5-метилцитозин. Любая аминогруппа в составе азотистых оснований с достаточно высокой вероятностью способна гидролизоваться. Остаток от гидролиза – замена аминогруппы на оксогруппу, а если происходит замена цитозина, то мы получаем урацил который является четным основанием и соответственно системой репарации вырезается, но если это 5-метилцитозин, то мы получаем тимин, а это легальное основание в составе ДНК. Соответственно если вот буква С не критична в соответствующем месте геномной последовательности, то эволюционное давление достаточно жесткое - замена буквы С на букву Т. Эволюционное давление будет больше в кодирующей последовательности и в промоторной последовательности, потому что метилированные CG последовательности являются важным регуляторным сигналом который контролирует. Это так называемые CPGS-права там где они есть почти наверняка будет регуляторная область, которая активирована. Таким образом если задача – подобрать редкощепящие рестриктазы, то потребуется подобрать такие рестриктазы в сайт которых входят эти комбинации нуклеотиды. Давайте посмотрим что получается.
Один из вариантов это электрофорез в пульсирующем поле. Стандартный электрофорез очень плохо подходит для фрагментов с более 50 тыс. н.п. Они все собираются в кучку наверху геля, не разделяются, некоторые из них вообще остаются в лунке. Чтобы их разделить меняются условия электрофореза – два электрода меняются на 4 и напряжение подается переменное то на один электрод, то на другой. Когда подается напряжение на первый электрод фрагмент ДНК движется очень короткое расстояние, застревает в порах агарозы. Напряжение меняется, ток подается на другие электроды, фрагмент ДНК выдергивается из тех ячеек в которых он застрял и чуть-чуть двигается, потом направление опять меняется. Движение получается зигзагообразное. Но шажки очень короткие и суммируются в линейное движение. Фактически получается обычный электрофорез, разница в том что крупные фрагменты будут четко разделены, т.к. подвижность совсем другая. Не так жестко привязана к массе фрагментов. У электрофореза есть один большой недостаток – это не прямое измерение размеров ДНК. По одной из дорожек будет бежать молекулярный маркер и идет сопоставление длины пробега – косвенный показатель.
То, что называется оптическим картированием – это замена электрофорезу, здесь размер фрагментов измеряется непосредственно. Суть его заключается в том, что ДНК одним из нескольких способов распрямляется, из скрученного клубка она вытягивается. Причем вытягивается под напряжением. Причем напряжение молекулы ДНК, обрабатываются рестриктазой, после разрезания концы молекулы разъезжаются в стороны от места разреза это все можно увидеть под микроскопом. Потом такой препарат микроскопируется, ДНК окрашивается интеркалирующим флуоресцентным красителем и места разрыва видны. Прямое измерение длины под микроскопом. Два варианта получения линейные напряженные ДНК: в обоих случаях используется свойство границы между различными фазами. Когда ДНК проходит через фазовый раздел вытягивается. Первая из методик использует ДНК в растворе расплавленной агарозы. ДНК наносится на предметное стекло, через некоторое время агароза начинает застывать. Застывание никогда не идет равномерно, оно всегда начинается в каком-то месте. Фронт кристаллизации агарозы движется с начальной точки и распространяется. Когда он проходит через молекулу ДНК он тянет эту молекулу за собой и в результате мы получаем выровненную молекулу в напряженном состоянии. Потом сюда добавляется фермент, в некоторых случаях фермент сразу иммобилизован на стекле, а потом добавляются ионы магния вместе с соответствующим буфером, а может быть наоборот – потом фермент. Но лучше первый вариант – лучше диффундирует. Другой метод основан на том что покровное стеклышко очень медленно достается из раствора ДНК. Оно обрабатывается раствором силаном который увеличивает сорбцию ДНК, молекулы какой-то частью сорбируются на этом стеклышке и оно очень медленно, по паре миллиметров в час вытаскивается из раствора и когда оно проходит через пленку поверхностного натяжения молекулы ДНК вытягиваются от того места где они зафиксированы вниз. Направление противоположное движению стеклышка. Мы получаем выровненную молекулу в напряженном состоянии, потом стеклышко обрабатывается рестриктазой.
При неспаренном состоянии гибридизации нет. Детекция SNP методом гибридизации в растворе. При гибридизации шпилька раскрывается.
Следующая методика картирования флуоресцентная гибридизация на препаратах – FISH.
Здесь непосредственно визуализуется какой-нибудь локус, в соответствии с позицией флуоресцентного зонда на окрашенных цитологическим красителем препарата хромосом (скрученные хромосомы). Препарат наносится на стекло, фиксируется на нем и подвергается частичной денатурации. В результате мы получаем по длине хромосомы участки в одноцепочечном состоянии. Затее добавляется проба которая гибридизуется с этими участками, и затем такой аппарат окрашивается соответствующими красителями и микроскопируется. Микроскопия ведется в видимом диапазоне, микроскопия флуоресцентная. Проба облучается лазером в определенной длине волны и наблюдается флуоресценция. В результате мы поучаем картину флуоресценции наложенную на характерную для данной хромосомы картину полос. Мы сделали зонд под конкретный ген и сразу видим где на хромосоме этот ген расположен.
Недостатки: разрешающая способность достаточно невысокая, не более 1 млн.н. п. между соседними зонами. Чтобы повысить разрешение используются модификации методик.
Самая простая фактически ничего не меняет – механическое растяжение хромосом. Препарат хромосом крутится в центрифуге на небольших оборотах. Хромосомы вытягиваются под действием центробежных сил, главное не переборщить с оборотами. Белки не соединяются остаются в тех позициях в которых они зафиксированы и можно окрасить. Разрешение в 4-5 увеличивается. До 200 тыс.н.п. между соседними маркерами. Если нужно более высокое разрешение используются другие модификации – не метафазные хромосомы (разрешение до 20-25 тыс.н.п.) и fiber-FISH, те же самые хромосомы, только которые дополнительно растянуты – растягивание в геле, молекулярное «причесывание», разрешение до 10 тыс. н. п. Недостаток этих двух методик – мы не можем привязать флуоресцентный зонд к цитологической карте. Мы можем только расположить 2 зонда друг относительно друга и определить расстояние между зондами. Должен быть зонд позиция которого известна, и мы должны одновременно видеть и этот зонд и тот зонд который нас интересует.
Еще один способ картирования это STS-картирование. Оно чем-то похоже на генетическое картирование, но использует не рекомбинацию, а другой способ определения относительного расстояния. Критерием здесь служит частота фрагментации ДНК при построении геномных библиотек и фрагментов. Фактически суть та же самая: разрыв молекулы ДНК происходит под действием низкого ультразвука или под действием рестриктаз. отличие также в том, что служит маркерами. STS-маркеры – это известные фрагменты ДНК, которые встречаются в геноме один раз и последовательность должна быть известна.
Когда такая последовательность известна можно подобрать пару праймеров в пределе этих 100-500 н. п. и получить ПЦР фрагмент, по которому обычно такой маркер и детектируется. Самый простой способ отбора последовательностей для получения этих маркеров – это использовать EST сиквенсы это коротенькие кусочки кДНК, сделанные на матричной РНК. Поскольку это копия мРНК это она гарантированно встречается один раз в геноме, поскольку большинство генов является уникальными. Соответственно это изначально уникальная последовательность. Другие маркеры, менее удобные, маркеры полиморфные по простым последовательностям – минисателлиты или микросателлиты. Можно использовать и случайные геномные последовательности, но с ними сложнее т.к. нужно четко доказывать что они уникальные геномные последовательности. Для того, чтобы определить позицию таких маркеров нужен другой компонент – реагент картирования. Это просто набор фрагментов ДНК той или иной библиотеки. Чем маркеры ближе друг к другу на реальной карте хромосомы, тем выше вероятность, что они окажутся в одном и том же фрагменте ДНК.
Тесно сцепленные маркеры, рядом расположены соответственно они попадают в большое число фрагментов. Маркеры расположенные дальше, чаще всего попадают на разные фрагменты ДНК, Если маркеры окажутся еще дальше – расстояние между ними будет превышать размер фрагментов библиотеки, они вообще не будут детектироваться совместно. Все это статистически общипывается – можно по частоте совместного нахождения этих маркеров в библиотеке достаточно точно определить расстояние между ними на реальной карте хромосом. При условии что фрагментация лишь случайна. Источники фрагментов: стандартная клонотека, набор клеток-радиационных гибридов.
Клетки-радиационные гибриды наиболее удобны при STS-картировании. Это старая технология, фактически вариант клонирования эукариотической ДНК in vivo. Речь идет о гибридизации облученных клеток с необлученными клетками. Причем необлученные клетки, как правило, клетки китайского хомячка, а облученные – клетки любого млекопитающего в т.ч. человека. Если допустить, что это человеческие клетки, они подвергаются воздействию очень высоких доз γ-радиации и такая клетка становится нежизнеспособной, мы получаем клетку с серьезно фрагментированной ДНК и репарировать такие хромосомы невозможно. Если такую клетку слить с клеткой другого млекопитающего, то система репарации неповрежденной клетки будет пытаться репарировать эти двунитевые разрывы и результатом будет случайные включения фрагментов вот этой ДНК в различные участки своих неповрежденных хромосом. То что не удалось включить при делении клетки будет элиминировано, а то что включилось будет стандартно наследоваться в этой клеточной линии. Поскольку в каждую хромосому включается несколько фрагментов чужеродной ДНК при правильной дозе радиации достаточно около 100 клеток ста линий таких гибридом для того, чтобы построить подробную STS-карту эукариотического генома.
При помощи ПЦР зафиксируется наличие маркеров в одном образце ДНК и высчитывается частота нахождения этих маркеров во всех вариантах линий. Есть различные механизмы автоматизации.
Суть его сводится к тому, что для детекции используется не электрофорез, а флуоресцентная метка, причем эта метка достаточно хитро сюда включается. Флуоресцентные нуклеотиды добавляются в реакцию, но система детекции способна улавливать только поляризованный сигнал, изначально сигнал не поляризован – детекция не идет. Ситуация включается при включении такого нуклеотида в состав ДНК. Эти нуклеотиды являются терминирующими поэтому они включаются только один раз и после включения флуоресцируют немного по-другому. Делается ПЦР, если продукт присутствует добавляется еще один внутренний праймер; он гибридизуется с одной из цепочек продукта и к нему присоединяется этот нуклеотид. После этого сигнал оказывается поляризованным и его можно детектировать. Если продукта нет – сигнала не будет. С такой модификацией ПЦР детекции можно в масштабах эукариотического генома достаточно быстро построить физическую карту генома.
Когда мы начали разговаривать про sts-картирование, я говорил, что второй вариант источника фрагментов для картирования только стандартная клонотека. Она, немножко менее удобна в том плане, что гораздо больше клонов приходится использовать, ниже получается частота совместного нахождения на одном фрагменте, но скрининг получается более протяженный. Но, есть преимущества, которые по крайней мере частично компенсируют этот недостаток, они заключается в том, что одни и те же клоны можно использовать и для построения карты и те же самые клоны можно затем брать для секвенирования. Одну и ту же клонотеку можно использовать для картирования, а потом для определения нуклеотидной последовательности, поэтому тут не надо специально что-то конструировать, а уже имеющуюся клонотеку можно использовать для такого картирования.
Ну вам может быть рассказывали когда была цитология, про принцип fluorescence assisted cell sorting, то есть окрашивание этих клеток идет флуоресцентным красителем, то есть очень небольшая модификация этой методики позволяет открывать не клетки, а хромосомы. И этот принцип соответственно позволяет разделить весь хромосомный набор на отдельные хромосомы и затем, библиотеки делаются из ДНК одной хромосомы. Это колоссальная помощь потому что, одно дело работать в масштабе генома размером 3 млрд нуклеотидных пар, другое дело в масштабе одной хромосомы, тогда у нас получится в среднем 150 млн. Вы чувствуете, как падают масштабы и естественно этот метод используется. Я надеюсь, что вы это хорошо помните, здесь все предельно просто. То, что нужно сортировать, окрашивается флуоресцентным красителем, в данном случае хромосомы. Количество красителя, который связывается с хромосомой зависит от нескольких факторов, в первую очередь от размера хромосомы – это основной фактор, ну и во вторую очередь – это структура белков, которые связаны с этой хромосомой. Белки немножко различаются, в первую очередь различаются количеством гетерохроматина, ну это определяет то, что нет прямой корреляции между размером хромосомы и интенсивностью окрашивания. Ну, что происходит потом, потом раствор капается из пробирки маленькими каплями, каждая концентрация подобрана таким образом, чтобы капля была либо пустой, либо содержала одну хромосому, ни в коем случае не две. Затем капля сбоку освещается лучом лазера, и если в капле присутствует хромосома, то возбуждается флуоресценция, флуоресценция детектируется детектором. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству красителя, который связался. Это количество характеризует каждую хромосому уникальным образом, вот на этой стадии можно сказать, какая хромосома в этой капле находится. Затем вот эта пара электродов в соответствии с интенсивностью флуоресценции заряжает каплю так, что получается достаточно мощное электрическое поле. Чем больше флуоресценция, тем больше заряд капле сообщается. Капля летит дальше, пройдя через следующую пару электродов. Эти электроды отклоняют каплю вправо или влево в соответствии с зарядом. Чем больше заряд, тем больше будет отклонение в одну сторону, в одну сторону она в общем будет отклоняться и соответственно каждая хромосома будет капать в свою пробирку. Правильный подбор красителя в случае хромосом человека позволяет таким образом раскапать все кроме одной пары хромосом по отдельным пробиркам. Для оставшейся пары хромосом берут другой краситель, который немного по другому связывается и эту пару тоже можно разделить. Таким образом, мы получаем из тотального препарата ДНК препараты отдельных хромосом, что существенно упрощает дальнейшую работу. На этом мы с картированием и библиотеками заканчиваем.
Генетическое картирование до сих пор используется и будет использоваться т.к. помимо составления карт генома у него есть важное применение – есть методика маркерсистированной селекции которая позволяет очень быстро вводить нужный ген.
Генотип такого нового сорт из дикого четко контролирует присутствие этого гена по молекулярному маркеру. Недостаток заключается в ограниченной точности. для E.coli и дрожжей генетическое картирование шло с 50х гг и была картирована тысяча генов. В случае E.coli и дрожжей максимальная плотность таких карт один ген на 3тыс.н.п. у E.coli и один ген на10 тыс.н.п. у дрожжей. И в том и в другом случае получается что удается картировать только каждый третий, каждый четвертый ген . Большей точности достигнуть не получается. Вторая проблема связана с тем что кроссинговер идет неравномерно по длине хромосомы , есть горячие точки кроссинговера, есть участки хромосомы которые блокируют кроссинговер – это вносит дополнительную ошибку и кроме того может поменять позиции некоторых локусов на генетической карте. Также из-за неаккуратности увеличивается число экспериментальных ошибок.
У картирования 2 задачи – определить относительное расположение каких-то участков на хромосоме , а вторая задача – определить расстояние между ними . Т.е. на счет относительного расположения ген картирование более или менее справляется с этим, если посмотреть на слайд позиции этих маркеров совпадают, кроме двух они переставлены местами, очевидно здесь присутствует какая-то аномалия. Что касается расстояния между маркерами, то здесь уже все несколько хуже – вы видите что некоторые расстояния оказываются несколько больше, некоторые несколько меньше чем реальные расстояния. Соответственно сейчас все больше и больше значения приобретают методики физического картирования, которые сейчас являются неотъемлемой частью геномного проекта как при классическом подходе к секвенированию, так и при шотган подходе, потому что в большинстве случаев для ликвидации пробелов на стадии финиширования все равно без карты не обойтись, особенно для эукариотических геномов.
Картирование генов - определение положения данного гена на какой-либо хромосоме относительно других генов. Используют три основные группы методов картирования генов – физическое (определение с помощью рестрикционных карт, электронной микроскопии и некоторых вариантов электрофореза межгенных расстояний – в нуклеотидах), генетическое (определение частот рекомбинаций между генами, в частности, в семейном анализе и др.) и цитогенетическое (гибридизации in situ, получение монохромосомных клеточных гибридов, делеционный метод и др.). В генетике человека приняты 4 степени надежности локализации данного гена – подтвержденная (установлена в двух и более независимых лабораториях или на материале двух и более независимых тест - объектов), предварительная (1 лаборатория или 1 анализируемая семья), противоречивая (несовпадение данных разных исследователей), сомнительная (не уточненные окончательно данные одной лаборатории).
Генетическое картирование предполагает определение расстояний по частоте рекомбинаций между генами. Физическое картирование использует некоторые методы молекулярной генетики для определения расстояния в нуклеотидах. Генетическое картирование - это определение группы сцепления и положения картируемого гена относительно других генов данной хромосомы.
Чем больше генов известно у данного вида, тем точнее результаты этой процедуры. Как правило, число генов в группах сцепления зависит от линейных размеров соответствующих хромосом. Однако, протяженные области конститутивного гетерохроматина (в районе центромеры и теломерных участков) практически не содержат генов и, таким образом, нарушают эту зависимость.
На первом этапе картирования определяют принадлежность гена к той или иной группе сцепления. Как известно, у D. melanogaster вдиплоидном наборе четыре пары хромосом: первая пара - половые хромосомы (XX - у самок, XY - у самцов), вторая, третья и четвертая - аутосомы. Число генов в Y-хромосоме самцов очень мало. Для локализации вновь возникшей мутации необходимо располагать набором маркерных генов для каждой хромосомы. Картирование мутации основывается на анализе ее сцепления с этими маркерами. Например, если интересующая нас мутация наследуется независимо от маркеров второй хромосомы, делается вывод о ее принадлежности к другой группе сцепления.
О значении картирования генов, и в первую очередь генов человека, говорит создание Международной программы "Геном человека ", которая ставит перед собой грандиозную задачу картировать все гены человека и секвенировать полностью всю ДНК генома. Программа разрабатывается в сотнях лабораторий во многих странах мира. Используются методы молекулярной биологии, цитогенетики и генетики соматических клеток. Разработаны критерии, определяющие достоверность картирования. Определены различные уровни достоверности локализации гена.
Важным вкладом в развитие генетики стала хромосомная теория наследственности, разработанная, прежде всего, благодаря усилиям американского генетика Томаса Ханта Моргана и его учеников и сотрудников, избравших объектом своих исследований плодовую мушку Drosophila melanogaster . Изучение закономерностей сцепленного наследования позволило путем анализа результатов скрещиваний составить карты расположения генов в «группах сцепления» и сопоставить группы сцепления с хромосомами (1910-1913 гг.).
